ＰＣＲ及其改進技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
                                                                                                柳洪芳１，宋　慧２

                                               （１．黑龍江省農(nóng)墾科學院測試化驗中心，黑龍江佳木斯１５４００７；２．吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院）

摘要：簡述了ＰＣＲ及其幾種改進技術(shù)，并對其在食品微生物檢測中的應(yīng)用進行綜述。
關(guān)鍵詞：ＰＣＲ改進技術(shù)；食品微生物；檢測

     民以食為天，食以安為先。食品**是關(guān)系到人體健康和國計民生的重大問題。食品中的微生物是人類許多**發(fā)生的根源之一，隨著人們對食品**性認識的不斷提高，傳統(tǒng)的微生物檢測方法因檢測成本高、速度慢、效率低等問題，難以滿足現(xiàn)代社會快速檢測的要求。而ＰＣＲ及其改進技術(shù)以其特異性強、快速準確和靈敏度高等優(yōu)點在食品微生物檢測領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

１　常規(guī)ＰＣＲ技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
　　多聚酶鏈式反應(yīng)（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?。悖瑁幔椋睢。颍澹幔悖簦椋铮睿校茫遥┦牵保梗福的昝绹模耍粒遥佟。停眨蹋蹋桑拥热藙?chuàng)建的一種在體外快速擴增特定基因或ＤＮＡ序列的方法，也稱基因的體外擴增法，其擴增過程包括以下３個步驟：①變性，即將模板雙鏈ＤＮＡ序列置于９５℃高溫下，使其變性解鏈成兩個單鏈模板。②退火，低溫（５０～６５℃）時，使人工合成的兩個引物與單鏈ＤＮＡ模板特異性地互補結(jié)合。③延伸，在適宜的溫度（７２℃）下，ＤＮＡ 聚合酶以單鏈ＤＮＡ 為模板，沿５，→３方向摻入核苷酸，使引物延伸合成模板的互補鏈，這就是新合成的ＤＮＡ雙鏈。新合成的ＤＮＡ雙鏈又可作為擴增的模板，繼續(xù)重復以上的ＤＮＡ多聚酶鏈反應(yīng)程序，就使得ＤＮＡ 片斷得到有效的擴增。
     ＰＣＲ技術(shù)具有快速、靈敏、操作方便等優(yōu)點，早在１９９２年ＮＡＫＡ?。剩桑停痢。龋郏保堇茫校茫曳椒▽Σ≡M行檢測，而利用ＰＣＲ技術(shù)檢測食品中病原微生物到近些年來才比較廣泛應(yīng)用。劉勝貴［２］等人利用ＰＣＲ技術(shù)檢測豬肉中沙門氏菌，對已知和未知被沙門氏菌污染的豬肉的培養(yǎng)物均能準確檢測。對不同稀釋度的樣品進行ＰＣＲ擴增，當ＤＮＡ含量只有０．０１ｐｇ時，還能擴增出條帶，說明該方法檢測豬肉中沙門氏菌具有特異性高且靈敏、快速等特點。巢國祥［３］等人通過ＰＣＲ法擴增ｈｌｙ基因建立快速檢
測單核細胞增生性李斯特氏菌（Ｌｍ）的方法。并檢測模擬污染生豬肉、水和牛奶，檢測限達１０ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。該方法對Ｌｍ的鑒定具有特異性強、靈敏度高、速度快和易操作等優(yōu)點，可用于食品的Ｌｍ的分離檢測。

２?。校茫腋倪M技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
　　隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和各項新技術(shù)與ＰＣＲ技術(shù)的有機結(jié)合，衍生出一些ＰＣＲ改進技術(shù)。主要介紹實時熒光定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ＩＭＳ－ＰＣＲ、ＤＧＧＥ－ＰＣＲ等４種ＰＣＲ改進技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用。
２．１　實時熒光定量ＰＣＲ技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
實時熒光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?。疲欤酰颍澹螅悖澹睿簦眩酰幔睿簦椋簦椋觯濉。校铮欤恚澹颍幔螅濉。茫瑁幔椋睢。遥澹幔悖簦椋铮睿┘夹g(shù)，是指在ＰＣＲ反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個ＰＣＲ進程，*后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。此技術(shù)于１９９６年由美國Ａｐｐｌｉｅｄ?。拢椋铮螅螅簦澹恚蠊就瞥?，該技術(shù)實現(xiàn)了ＰＣＲ 從定性到定量的飛躍，除了具有常規(guī)ＰＣＲ的快速、靈敏、操作方便等特點外，還具有以下優(yōu)點：全封閉反應(yīng)，無需凝膠電泳等ＰＣＲ后處理，減小對環(huán)境的污染；不使用有毒試劑，操作**；定量準確；儀器在線實時監(jiān)測，結(jié)果直觀。該技術(shù)的諸多優(yōu)點使之在食品微生物的檢測中的應(yīng)用越來越廣泛。李光偉［４］等針對沙門氏菌ｆｉｍＹ 基因，設(shè)計特異引物和探針，建立了檢測食品中沙門菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ方法。其檢測靈敏度為１８０ｃｆｕ／ｍＬ，與國標法檢出的陽性樣本數(shù)基本保持一致，準確率達９９．７％。高虹［５］等建立了奶粉中阪崎腸桿菌ＲＴＱ－ＰＣＲ檢測方法。其所建立的方法特異性強，靈敏度高，在２．２～５．４ｃｆｕ／ｌ００ｇ范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；與ＦＤＡ方法比對實驗表明，兩種方法的檢測結(jié)果完全一致。翁文川［６］等人針對單增李斯特氏菌溶血素基因（ｈＩｙＡ），設(shè)計特異的引物ＴａｇＭａｎ探針，優(yōu)化體系，建立了食品中單核細胞增生李斯特氏菌的熒光定量ＰＣＲ檢測方法，該方法檢測低限為１ｃｆｕ／ｇ，整個流程只需２７ｈ。與傳統(tǒng)方法進行對比，結(jié)果一致。Ｌｋｅｄａ［７］等根據(jù)金黃色葡萄球菌的ｓｅａ和ｎｕｃ基因設(shè)計引物，建立了脫脂奶粉中金黃色葡萄球菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ檢測方法。
２．２　多重ＰＣＲ技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
    多重ＰＣＲ是通過對普通ＰＣＲ技術(shù)的改進而建立起來的一種技術(shù)，是將多條引物和多條模板混合在一個反應(yīng)體系中分別特異擴增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板ＤＮＡ混合在同一反應(yīng)體系中擴增同一模板的不同片斷，常用于對超長片斷的擴增。與常規(guī)的ＰＣＲ相比，還具有擴增效率高、產(chǎn)物特異性高和經(jīng)濟簡便等特點，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測。梁會營［８］等根據(jù)阪崎腸桿菌外膜蛋白Ａ（ｏｍｐＡ）基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（ｎｕｃ）基因序列，設(shè)計兩對特異性引物，并優(yōu)化了ＰＣＲ的條件，建立了嬰幼兒奶粉中常見病原菌的多重ＰＣＲ檢測方法。結(jié)果表明，該方法具有很高的特異性，混菌檢測靈敏度達到１０３ｃｆｕ／ｍＬ，為快速檢測奶粉中病原菌提供了有效手段。陳偉［９］等對金黃葡萄球菌的ｎｕｃ基因、單增李斯特菌的ｈｌｖ基因和蠟樣芽孢桿菌的ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ基因設(shè)計了引物，建立了３種致病菌的多重ＰＣＲ檢測體系，結(jié)果顯示該方法檢測結(jié)果與單基因ＰＣＲ檢測的靈敏度相同，結(jié)果穩(wěn)定。整個檢測過程在１６ｈ內(nèi)完成，檢測靈敏度可達ｌｃｆｕ／ｍＬ。王艷君［１０］等人針對沙門氏菌編碼ＤＮＡ結(jié)合蛋白
的基因ｈｎｓ、大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７編碼外膜蛋白緊密素的基因ｅａｅＡ 和單核細胞增生李斯特氏菌溶血素Ｏ基因Ｈｌｙ設(shè)計３對引物，建立同步檢測肉制品中３種致病菌的多重ＰＣＲ方法。通過對多重ＰＣＲ特異性和靈敏度進行分析及對多重ＰＣＲ反應(yīng)條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，該方法簡便、快速，可使混菌檢測靈敏度達到１０３ｃｆｕ／ｍＬ。ＫＡＷＡＳＡＫＩＳ［１１］等人利用多重ＰＣＲ方法同時檢測肉類中的沙門菌、李斯特菌和大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７，通過ＵＰＢ增菌培養(yǎng)基增菌后檢測敏感性可達到１ｃｆｕ／２５ｇ。

２．３?。桑停樱校茫壹夹g(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
**磁珠技術(shù)（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ?。猓澹幔洌蟆。簦澹悖瑁睿椋瘢酰澹螅┦牵玻笆兰o７０年代中期發(fā)展起來的一項新的**學檢測和分離技術(shù)。其原理是磁珠經(jīng)過一定的處理后，可結(jié)合某種微生物特異性抗體，形成**磁珠。將這種帶有特異性抗體的**磁珠加到待測樣品中，相應(yīng)的抗原物質(zhì)就會和**磁珠上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原－抗體－磁珠**復合物，此復合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動，使復合物與其他物質(zhì)分離，從而達到快速分離抗原物質(zhì)的目的［１２］。該技術(shù)不僅具備了固相化試劑特有的優(yōu)
點以及**學反應(yīng)的高度特異性，還具有高效、快速、可重復性好、操作簡單和不需昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點。現(xiàn)已在細胞分離和培養(yǎng)、生物大分子純化、**學及微生物學檢測等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)與ＰＣＲ結(jié)合，可大大縮短食品中致病菌檢測時間，同時也增加了檢測的特異性，克服ＰＣＲ檢測中易出現(xiàn)假陽性的弱點。近年來，ＩＭＳＰＣＲ技術(shù)已應(yīng)用于食品微生物的檢測中。李敏［１３］等研究表明，將ＩＭＳ與多重ＰＣＲ結(jié)合，２４ｈ內(nèi)即可檢出食品中的單增李斯特菌，*低檢測限可達１ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。王曉聞［１４］等建立了沙門氏菌的磁捕獲－ＰＣＲ檢測方法，實驗包括前增菌、**磁珠制備分離、ＤＮＡ提取及ＰＣＲ擴增，７ｈ即可完成檢測過程，且檢測靈敏度為９ｃｆｕ／ｍＬ。結(jié)果表明該方法操作簡便、用時短、檢出率高。翁文川［１５］等應(yīng)用抗李氏菌**磁珠從增菌肉湯中篩選和富集目的菌。通過熒光ＰＣＲ技術(shù)檢測李氏菌溶血素ｈｌｙＡ基因，建立了單增李斯特氏菌的**磁分離－熒光ＰＣＲ方法。該方法檢測肉類制品中單增李斯特氏菌簡便易行，可在２７ｈ內(nèi)完成，特異性好，檢測低限為１ｃｆｕ／ｇ。

２．４?。校茫遥模牵牵偶夹g(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的技術(shù)是Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ等于１９８９年**提出的，將ＰＣＲ 和變性梯度凝膠電泳的（ＤＧＧＥ）分析技術(shù)結(jié)合起來是一種可將長度相同而序列不同的ＤＮＡ 片段混合物分離開的一項技術(shù)。ＤＧＧＥ的基本原理是：由于ＤＮＡ分子中４種堿基的組成和排列存在差異，造成不同序列的ＤＮＡ分子的解鏈溫度不同，解鏈時所需的變性劑
的濃度也不同。當雙鏈ＤＮＡ 分子在含梯度變性劑（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，會致使序列不同的ＤＮＡ片段會在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，從而使ＤＮＡ分子的遷移速度不斷下降，當產(chǎn)生的遷移阻力與電場力相對平衡時，不同序列的ＤＮＡ 片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的帶譜。理論上只要選擇的電泳條件足夠精細，有一個堿基差異的ＤＮＡ長段都可以被分開。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技術(shù)具有可檢測不可培養(yǎng)類細菌、檢測時間短、檢測率高、重復性好等優(yōu)點。近些年來，此技術(shù)在食品中檢測微生物后應(yīng)用也有報道。ＣＯＣＯＬＩＮ［１６］等建立一種直接檢測食品中李斯特菌屬的分子生物學方法。通過ＰＣＲ擴增李斯特菌和標準菌株的特異ｉａｐ基因，擴增產(chǎn)物再用ＤＧＧＥ進
行分離，鑒定出五種李斯特菌。李苗云［１７］等研究冷卻豬肉貯藏過程中的微生物變化，直接提取不同冷藏天數(shù)肉樣ＤＮＡ，對細菌１６ＳｒＤＮＡ的ｖ６－ｖ８區(qū)段進行ＰＣＲ 擴增，通過ＤＧＧＥ 及序列分析，結(jié)果表明，冷卻豬肉耗氧貯藏過程中的微生物主要有：熱殺索絲菌、莫拉氏菌、氣單胞菌、假單胞菌、葡萄球菌和節(jié)桿菌，為快速檢測冷卻豬肉中的微生物污染提供新思路。
　　總之，由于ＰＣＲ及其改進技術(shù)可以快速特異地擴增任何期望的ＤＮＡ 片斷和目的基因，使其在食品微生物檢測領(lǐng)域已有著實際的應(yīng)用。但在實際應(yīng)用中也表現(xiàn)出一些缺陷，例如由于引物之間的抑制或引物和其它模板間的非特異性結(jié)合可能導致出現(xiàn)假陽性；實驗條件不當可能導致產(chǎn)物產(chǎn)生突變；引物設(shè)計及靶序列選擇不當可能降低靈敏度和特異性等。盡管還存在著一定的問題，相信隨著ＰＣＲ及其改進技術(shù)的進一步發(fā)展和完善，ＰＣＲ及其改進技術(shù)在食品微生物檢測領(lǐng)域會有更加廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮更大的作用，必將把食品微生物檢測技術(shù)帶入一個新階段。