ATP 生物發(fā)光技術在微生物檢測中的應用

尹子波1，侯玉柱1，2，尹建軍1，2，*，宋全厚1，2

（1．中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027；2．國家食品質量監(jiān)督檢驗中心，北京100027）

摘要：ATP（三磷酸腺苷）生物發(fā)光法作為一種不斷完善成熟的微生物快速檢測方法，具有簡便、快速、高靈敏度等優(yōu)點。對該方法的歷史發(fā)展、檢測原理、目標物提取方法、應用領域和*新研究成果等做重點介紹，并對ATP 生物發(fā)光法的應用現(xiàn)狀和發(fā)展方向進行總結和展望。

關鍵詞：ATP 生物發(fā)光法；熒光素—熒光素酶；**磁分離技術（IMS）；生物**納米磁微粒（BMNPs）

     微生物污染嚴重威脅著人類的身體健康與生命**，目前國際上檢測微生物的標準方法是營養(yǎng)瓊脂平板計數法（PCA），但PCA 法需37 ℃下培養(yǎng)48 h，操作繁瑣，不能做到快速檢測?，F(xiàn)在國內外開始廣泛的研究與應用各種微生物快速檢測技術，如**學方法（ELISA[1-2）] 、電阻抗測量法[3]、快速紙片法[4]、核酸法[5]、微菌落技術[6]等。ATP 生物發(fā)光法具有簡便、快速、靈敏度高的優(yōu)點，適合對微生物污染進行實時監(jiān)控，符合食

品加工企業(yè)的需求。目前，國內外對該方法進行了大量的研究與應用。ATP 生物發(fā)光技術在微生物檢測中的應用

1 ATP 生物發(fā)光法的發(fā)展歷史、原理及檢測步驟

1.1 ATP 生物發(fā)光法的發(fā)展歷史

ATP 的生物發(fā)光機理*早在1949 年由McEIroy和Strehler 提出[7]。1983 年，James D. Moyer 和J. FrankHenderson[8]提出細胞內源性ATP的含量可以反映細胞的活性和活細胞的數量。1985 年，de Wet，J . R 等[9]**克隆了北美熒火蟲（P. Pyralis） 的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）基因，并在大腸桿菌（E.coli）中表達，從中得到具有活性的蟲熒光素酶。該酶分子量為62 ku，與熒光素反應能夠產生波長為560 nm 的熒光。20 世

紀80 年代，英國人首先研制出ATP 檢測儀，隨后發(fā)展到歐洲、美國和日本。2002 年，我國衛(wèi)生部頒發(fā)了食品加工企業(yè)HACCP （Hazard Analysis and Critical Control Point）實施指南，鼓勵食品企業(yè)引入ATP 生物發(fā)光快速檢測系統(tǒng)。目前，在餐飲服務食品**現(xiàn)場快速檢測設備配備基本標準中，ATP 生物發(fā)光快速檢測系統(tǒng)被應用于環(huán)境潔凈度的評估檢測。

1.2 生物發(fā)光法的原理

ATP 生物發(fā)光法的原理就是在熒光素酶E（luciferase）和Mg2＋的作用下，熒光素LH2 （ luciferin）與ATP發(fā)生腺苷?；换罨?，活化后的熒光素與熒光素酶相結合，形成了熒光素—AMP 復合體，并放出焦磷酸（PPi）。該復合體被分子氧氧化，形成激發(fā)態(tài)復合物P*-E·AMP，放出CO2，當該復合物從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)射光。并*終形成氧化蟲熒光素P 和AMP[10]。反應過程如下：

E+LH2+ATP E·LH2-AMP+PPi （1）

E·LH2-AMP+O2 [P*-E·AMP]+CO2 （2）

E-P+hv+AMP （3）

經過實驗表明，熒光素酶為非典型的Michaelis-Menten 氏酶[11]，*適pH 為7.5，對其作用底物之一—ATP 的酶促動力學曲線呈S 型。在適當低的ATP 濃度范圍內，其反應的速度與ATP 濃度成**反應的關系，即檢測的熒光值強度與ATP 濃度成一定比例關系。對于一定生理時期內的活體微生物，均有較恒定水平ATP 含量，使得ATP 濃度與活體微生物含量之間

有較好的線性關系。而且微生物死亡后，其體內的ATP 會很快被胞內酶所降解，不會對活體微生物的測定產生影響。ATP 這些特點，使ATP 生物發(fā)光法成為較好的活體微生物的檢測方法。

1.3 檢測步驟

ATP 生物發(fā)光法檢測微生物的一般步驟：預先制作樣品微生物含量與ATP 生物發(fā)光值標準曲線，然后取樣、提取ATP、加入酶反應試劑、測定樣品微生物ATP發(fā)光值、*后根據標準曲線推算出樣品中微生物實際數值。

2 ATP 生物發(fā)光法優(yōu)缺點

ATP 生物發(fā)光法檢測的優(yōu)點主要是快速、簡便、靈敏度高。從20 世紀80 年代以來，該方法的檢測限由10-14 mol 提高到了10-18 mol[12]，每次檢測微生物ATP的時間可以控制在幾分鐘之內，是目前檢測微生物數目*快捷的方法。其缺點是不能區(qū)分微生物與非微生物ATP，不能特異性地區(qū)分微生物的種類，并且樣品本身和ATP提取劑等含有的某些離子會對ATP的測定造成干擾和抑制發(fā)光作用，其靈敏度仍不能滿足某些樣品的直接檢測要求，如飲用水中菌落總數不能超過100 cfu/mL，而目前直接檢測限為1 000 cfu/mL[13]。

3 微生物ATP 提取方法的研究

ATP 生物發(fā)光法的關鍵步驟是如何提取胞內ATP。目前，針對ATP 提取方法的研究有很多，主要有加熱裂解、超聲、酸、有機提取劑方法等。考慮到提取方法的簡便與實用性，ATP 提取劑是*為常用的一種方法，對于一種好的提取劑而言，首先要保證能夠快速提取細菌ATP 并且不會降解細菌ATP，其次對后續(xù)的ATP 檢測系統(tǒng)干擾*小或無干擾。舒柏華，趙志耀等[14]過對超聲、加熱超聲、加熱、三***（TCA）、氯仿等5 種萃取方法進行的比較，結果顯示：超聲加熱方法*佳, 加熱法次之。它們對微生物ATP 分析抑制較小，且ATP 萃取率高，但需附加設備，操作繁瑣，難于推廣。伍季、朱海華等[15]研究了季胺鹽類表面活性劑提取細菌ATP 方法，并將該法與傳統(tǒng)TCA 方法的提取效果做了比較，他們選擇了幾種裂解效果較好的表面活性劑苯扎氯銨（BAC）、苯扎溴銨（BAB）、雙癸基二甲基溴化銨（DDAB）、雙十烷基二甲基氯化銨（DDAC）、十二烷基硫酸鈉（SDS）等作為ATP 提取劑的主要成分進行了實驗研究，優(yōu)化提取條件，并將傳統(tǒng)的TCA 法與這些方法的ATP 提取效果進行了對比。實驗結果表明，采用苯扎氯銨提取細菌ATP 優(yōu)于TCA 和其他表面活性劑方法。然而，提取劑中的表面活性劑或多或少都會干擾熒光素—熒光素酶系統(tǒng)，造成微生物ATP 檢測值的降低，從而降低靈敏度。Lundin. Arne 和Anson. John George[16]研究采用惰性中和劑與ATP 提取劑相結合的方法，從而有效降低或消除提取劑對酶活性的抑制作用。該方法操作簡單、迅速。其原理主要是利用環(huán)糊精的特殊結構—6～8 個葡萄糖分子組成環(huán)形結構，內部疏水基團可與表面活性劑的疏水尾部牢固結合，外部親水基團對酶活性無抑制作用，從而達到使表面活性劑與酶分離的目的，降低或消除表面活性劑對酶活性的抑制作用。Nae-Cherng Yang 和Wai－Meng，Ho[17]等比較了高氯酸（HClO4）、硼酸緩沖液加熱、去離子水（DW）加熱等提取方法對細胞ATP 檢測的影響。實驗表明，HClO4、磷酸緩沖鹽（PBS）、三羥甲基硼酸緩沖液（Trisborate

buffer）、一種溶菌緩沖液（lysis buffer）均對發(fā)光值有較大的抑制作用，而DW（煮沸的去離子水）法發(fā)光值*高，能使ATP 水解酶變性失活，同時對細胞ATP 有很好的提取效果。與其他方法相比有簡單、迅速、高效的優(yōu)點，如HClO4 方法需中和，PBS 方法需進一步的加熱條件。但該方法僅局限于細胞ATP 的提取。

4 應用

4.1 在水中微生物檢測領域的應用

由于水的基質比較簡單，同時對酶的活性影響比較小，所以目前該方法檢測水中微生物的應用*為廣泛。吳慧清、李程思等[18]利用ATP 生物發(fā)光法檢測飲用水中的微生物含量。他們采用微濾膜技術過濾富集水中的微生物，然后加入緩沖劑和發(fā)光劑檢測熒光值，經過實驗比較，孔徑為0.22 μL 和0.45 μL 的膜截留細菌率相差不大，但0.45 μL 膜過濾速度遠快于0.22 μL膜。因此建議采用0.45 μL 孔徑的膜。該方法操作簡單，成本低，檢測結果能夠成功反映出水中微生物總數。

4.2 在乳品工業(yè)生產中的應用

李春艷、霍貴成等[19]研究了ATP 生物發(fā)光法在生牛乳中微生物檢測的應用，他們首先將生乳用PBS 緩沖液稀釋20 倍，取50 μL 加入滴體細胞裂解劑混勻并過濾，然后膜上加入2 滴細菌裂解劑，再加入50 μL 酶反應試劑，用槍反復吹吸3 次后測熒光值。實驗表明，

ATP 生物發(fā)光法檢測結果與培養(yǎng)及平板計數法結果之間有良好的線性關系（r=0.948 5），相關程度為顯著相關（p<0.001）。

4.3 在肉類微生物檢測中的應用

舒伯華、孫丹陵等[20]研究了ATP 生物發(fā)光法在肉類食品中微生物檢測的應用，實驗結果表明，生肉類食品由于體細胞ATP 對結果的干擾較大，因此需要**掉樣品中體細胞ATP，其采用的方法是首先用0.2 %的TritonX-100 和0.15 %的apyrase 混合液**體細胞ATP，然后加入3 %的三***混合并振搖1 min，離心后取上清檢測ATP，該光值即為細菌ATP 發(fā)光值，整個過程需15 min。而熟肉類中非細菌ATP 含量低，對結果影響較小可以省略**體細胞ATP 步驟而直接測定，整個過程需4 min。經過38 份樣品實驗對比，ATP 生物發(fā)光法檢測結果與細菌菌落平板計數方法之間具有良好的線性關系（r=0.98）。

4.4 在物體表面微生物檢測中的應用

曹利蓉、張偉等[21]研究了ATP 生物發(fā)光法在餐具表面微生物污染檢測方面的應用，他們首先在選定測試區(qū)域內，滴加2 滴ATP 釋放液，用無菌棉拭子均勻涂抹測試樣品，采樣面積為100 cm2；然后在棉拭子頭部滴加6 滴ATP 釋放液，提取ATP；*后立即將拭子頭部ATP 提取液點在檢測膜上，用ATP 熒光儀測定生物發(fā)光值（RLU），同時采用國標法檢測大腸菌群和細

菌總數。其中規(guī)定大腸菌群陽性為不合格，細菌總數以大于500 cfu/100 cm2 為不合格，ATP 生物發(fā)光法以RLU 大于600 為不合格。在282 份樣品中，3 種檢驗方法所測出不合格樣本的陽性率分別為23.4 ％，25.5 ％，9.4 ％。ATP 生物發(fā)光法的陽性率與大腸菌群和細菌總數的陽性率沒有顯著性差異（P＞0．05）。

4.5 在啤酒中的應用

伍季、王燕等[22]研究了ATP 生物發(fā)光法快速檢測啤酒中的微生物技術。他們采用0.45 μL 濾膜真空過濾1 L 啤酒，將過濾后的濾膜置于無菌的試管中，然后加入250 μL 0.2 mol/L Tris—乙酸和250 μL ATP 抽提劑，抽提60 s，抽提完成后，取100 μL 溶液與100 μL

熒光素—熒光素酶溶液混合均勻，檢測發(fā)光值。實驗結果表明，啤酒中菌落總數與生物發(fā)光值之間有顯著的相關性（R2=0.998 5）。經過實際啤酒樣品的檢測，利用ATP生物發(fā)光法判斷啤酒是否合格的結果與平板計數法判定結果一致。

4.6 在面粉中的應用

李利霞、伍金娥等[23]優(yōu)化了ATP 生物發(fā)光法，并快速檢測面粉中的微生物總數。在所優(yōu)化的方法中，D-熒光素濃度為70 mg /L，熒光素酶濃度為50 mg /L，Mg2+濃度為0. 25 mmol/L。用無菌生理鹽水將面粉稀釋后，分別用ATP 生物發(fā)光法和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法計菌落總數，兩者結果無顯著性差異，同時該法還具有良好的重現(xiàn)性（RSD＝4．0 ％）。實驗證明ATP 生物發(fā)光法可以方便快捷、準確穩(wěn)定的檢測出面粉中微生物總數。

4.7 與**分離技術結合的應用

目前，國內外研究較多的是**磁分離技術與ATP 生物發(fā)光技術（IMS/ATP）兩者結合檢測水中微生物的方法。其主要原理是采用目標菌抗體包被的磁珠從樣品中將目標細菌分離，然后洗脫并富集目標細菌，*后采用ATP 生物發(fā)光技術檢測菌含量。該方法*初由Lee 和Deininger[24]應用到檢測水中的大腸桿菌含量。隨后Bushon 等[25]將該方法做適當的改進，采用多克隆抗體技術并用來檢測水中的大腸桿菌和糞腸球菌。該方法既特異性檢測了目標菌，又對其進行了濃縮，提高了檢測限。Rebecca N. Bushon 等[26]采用該方法檢測了

廢水中大腸桿菌和糞腸球菌的含量，實驗結果表明，IMS/ATP 方法結果與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)結果具有較好的線性關系。Yuxiao Cheng 和Yajun Liu 等[27]在此基礎上研究了生物**納米磁微粒BMNPs （直徑約為20 nm）技術。該方法關鍵步驟是構建合適的納米**磁微粒，

他們首先將抗生物素蛋白結合并覆蓋到納米磁微粒表面起到架橋的作用，然后再將生物素標記的抗體結合到抗生物素蛋白上構成BMNPs。與其他方法相比，該方法具有更強的抗原抗體作用力、更多的抗原抗體識別位點。因此，該方法可以結合更多的目標微生物。結果表明，在低濃度情況下，BMNPs 可以結合≥90 %的大腸桿菌，而普通大小的磁珠顆粒僅能結合大約50%的目標菌。同時該方法的*低檢測限為20 cfu/mL，作用時間為1 h，要遠優(yōu)于其它方法。如噬菌體熒光技術（FBA）[28] 在原奶中大腸桿菌檢測限為10 cfu/mL~100 cfu/mL，且需10 h 的富集培養(yǎng)時間。流式抗體檢測器技術[29]的大腸桿菌檢測限為1.7×105 cfu/mL，需時間30 min。酶聯(lián)**磁分離—化學發(fā)光法[30]的大腸桿菌檢測限為1×105 cfu/mL~1×106 cfu/mL，需時間1.5 h。

5 結論與展望

ATP 生物發(fā)光法具有快速、簡單方便、靈敏度高的特點，與其它的微生物快速檢測方法相比有著巨大優(yōu)勢，目前在食品加工行業(yè)中正不斷推廣應用。但該方法存在著容易受到外界因素的干擾，不能定性鑒別微生物種類，對于某些樣品的直接檢測靈敏度仍然達不到要求的缺點。因此，選取合適的ATP 提取劑，降低外界因素的干擾，增強對微生物的特異性識別，提高檢

測靈敏度成為改善和研究該方法的關鍵點。目前，新型的ATP 提取劑的研制已經取得了巨大的進步。同時，將其它新技術與ATP 生物發(fā)光法結合成為一種潮流，例如**磁分離與ATP 生物發(fā)光技術（IMS/ATP）。IMS/ATP 技術既降低了外界因素的干擾，對微生物也具有特異性識別能力，同時又極大提高了檢測靈敏度。但IMS/ATP 技術也有成本較高，設備相對較復雜的缺點。相信在不久的未來，隨著科技的不斷發(fā)展，ATP生物發(fā)光法檢測微生物的技術一定會更加成熟和完善，*終將應用到更加廣泛的領域。

參考文獻：

[1] Tsai Cousin GJ. Enzyme-Linked immunosorbent assay for detection

of molds in cheese and yogurt [J]. Journal of Dairy Science, 1990, 73

(12): 3366-3378

[2] 陳發(fā)榮, 羅舜菁, 劉成梅, 等. 酶聯(lián)**快速檢測方法在食品安

全中的應用[J]. 江西食品工業(yè), 2009(3): 49-51

[3] 賴蔚苳, 黃吉城, 戴昌芳, 等. 電阻抗法快速測定食品中菌落總

數的應用研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2001, 13(4): 13-15

[4] 許如蘇, 林彩華, 孫霞, 等. 應用測試片快速檢測食品中金黃色

葡萄球菌的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2009, 30(1): 94-97

[5] L Settanni, A Corsetti. The use of multiplex PCR to detect and

differentiate food and beverage associated microorganisms [J].

Journal of Microbiological Methods , 2007 ,69(1): 1-22

[6] Hadzieva NC, Hadziev ST. Bacterial microcolony -a possible

approach for a rapid differentiation of bacteria [J]. J Hyg Epidemiol

Microbiol Immunol, 1987, 31(2):189-195

[7] McElroy W D, Strehler B L. Factors Influencing the Response of the

Biolumineseent Reaction to ATP [J]. Arch Biochem, 1949, 22(3):

420-433

[8] James D Moyer, J Frank Henderson. Nucleoside triphosphate

specificity of firefly luciferase [J]. Analytical Biochemistry, 1983,

131(1): 187-189

[9] J R de Wet, K V Wood, D R Helinski, et al. Cloning of firefly

luciferase cDNA and the expression of active luciferase in

Escherichia coli [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82 (23): 7870-

7873

[10] Marlene DeLuca, William D. McElroy. Kinetics of the Firefly

Luciferase Catalyzed Reactions[J]. Biochemistry, 1974, 13(5): 921-

925

[11] 蔣宇揚, 金振華, 王書錦, 等. 螢火蟲熒光素酶分離純化及其特

性的研究[J]. 清華大學學報:自然科學, 1998, 38(6): 16-19

[12] Lundin A. Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass,

enzymes, and metabolites[J]. Methods in Enzymology, 2000, 305:

346-370

[13] 唐倩倩, 葉尊忠, 王劍平, 等. ATP 生物發(fā)光法在微生物檢驗中

的應用[J]. 食品科學, 2009, 29(6): 460-465

[14] 舒柏華, 趙志耀, 徐順清, 等. 利用生物發(fā)光分析技術快速檢測

微生物的方法學研究[J]. 發(fā)光學報, 1999, 20(1): 77-80

[15] 伍季, 朱海華, 章建軍, 等. 季銨鹽類表面活性劑對細菌ATP 提

取作用的研究[J]. 江西農業(yè)學報, 2008, 20(9): 124-125

[16] Lundin. Arne, Anson. John George. Method for extraction of

intracellular components: Europe: 0566625B1[P]. 1992-07-23

[17] Nae-Cherng Yang, Wai-Meng Ho, Yu-Hsuan Chen, et al. A

convenient one-step extraction of cellular ATP using boiling water

for the luciferin-luciferase assay of ATP[J]. Analytical Biochemistry,

2002, 306(2): 323-327

[18] 吳慧清, 李程思, 張菊梅, 等. ATP 生物發(fā)光法飲用水中細菌總

數快速測定方法研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2009, 19(6): 1975-

1978

[19] 李春艷, 霍貴成, 王德國, 等. ATP 生物發(fā)光法快速測定生乳中

微生物總數的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(7): 233-234

[20] 舒柏華, 孫丹陵, 王勝利, 等. 肉類食品細菌污染生物發(fā)光快速

分析技術研究[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2003, 19(4): 483-484

[21] 曹利蓉, 張偉, 晁蕊. ATP 生物發(fā)光法在鐵路站車食品器具衛(wèi)生

學檢驗中的應用[J]. 鐵道勞動**衛(wèi)生與環(huán)保, 2004,31(2): 86-

87

[22] 伍季, 王燕, 章建軍, 等. ATP 生物發(fā)光法快速檢測啤酒中的菌

落總數[J]. 河南科技, 2006, 24(1): 63-65

[23] 李立霞, 伍金娥, 常超, 等. 優(yōu)化的ATP 生物發(fā)光法快速檢測面

粉中細菌總數[J]. 安徽農業(yè)科學, 2011, 39(7): 4055-4057

[24] Lee J, Deininger R. Detection of E. coli in beach water within 1 hour

using immunomagnetic separation and ATP bioluminescence[J].

Luminescence, 2004, 19(1): 31-36

[25] Bushon R N, Brady A M, Likirdopulos C A, et al. Rapid detection of

Escherichia coli and enterococci in recreational water using an

immunomagnetic separation adenosine triphosphate technique[J].

Appl. Microbiol, 2009, 106(2): 432-441

[26] Rebecca N Bushon, Christina A Likirdopulos1, Amie M G Brady.

Comparison of immunomagnetic separation/adenosine triphosphate

rapid method to traditional culture-based method for E. coli and

enterococci enumeration in wastewater[J]. water research, 2009, 43

(19): 4940-4946