淺談PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用前景
摘要：
PCR技術(shù)是一種體外擴(kuò)增特定DNA序列的方法。該技術(shù)以其高特異性和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)已廣泛用于各領(lǐng)域。本文主要對(duì)PCR技術(shù)的原理及其在一次性使用衛(wèi)生用品微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景等方面進(jìn)行綜述。
關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；衛(wèi)生用品；微生物；檢測(cè)
隨著科學(xué)研究的進(jìn)步，各種新技術(shù)不斷形成且廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。人們對(duì)一些生物指標(biāo)的檢測(cè)手段也進(jìn)入
到了一個(gè)新階段．分析研究對(duì)象更多的是選擇了DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。PCR (Polymerase Chain Reaction)技術(shù)以其高特異性和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、環(huán)境監(jiān)測(cè)及其他與DNA鑒定相關(guān)的領(lǐng)域。本文主要對(duì)PCR技術(shù)的原理及其在一次性使用衛(wèi)生用品微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景等方面進(jìn)行綜述。
1 PCR技術(shù)原理
PCROp聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)?，F(xiàn)代PCR概念*早是由美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis于20世紀(jì)80年代早期發(fā)明的，他也因此榮獲了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。如今該技術(shù)已成為生物前沿技術(shù)之一。
PCR技術(shù)的基本原理類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)PCR包括變性一退火～ 延伸三個(gè)基本反應(yīng)階段。其基本過(guò)程為：①檢測(cè)樣品經(jīng)預(yù)處理后獲得DNA模板②DNA模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95。C左右一定時(shí)間后．使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離后成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為其后階段反應(yīng)做準(zhǔn)備：③模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后．溫度降至55℃左右這時(shí)人工合成的弓1物與模板DNA單鏈經(jīng)互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合：④引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物在耐熱DNA聚合酶的催化作用下 以4種三磷酸脫氧核苷酸為反應(yīng)原料，靶序列為模板．按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原則 合成一條新的與模板DNA結(jié)構(gòu)組成相同的新鏈。重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過(guò)程．就可獲得更多的新鏈 而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，一般單一拷貝的基因循環(huán)25-30次DNA便可擴(kuò)增100萬(wàn)-200萬(wàn)倍。PCR反應(yīng)產(chǎn)物再通過(guò)凝膠電脈和基因測(cè)序等DNA分析技術(shù)確定擴(kuò)~~DNA序列的具體信息 。
2 PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景
依據(jù)一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB15979-2002)中的微生物指標(biāo)規(guī)定，在一次性使用衛(wèi)生用品中是不能有大腸桿菌以及3種致病性化膿菌(綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌)的檢出。該要**對(duì)4種菌的定性檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)中用到的檢測(cè)方法是傳統(tǒng)的微生物鑒定法，先通過(guò)增菌或分離培養(yǎng)．然后進(jìn)一步根據(jù)各菌群特征做一些鑒定試驗(yàn)．*后綜合各項(xiàng)結(jié)果判斷。通常這種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法時(shí)間較長(zhǎng)，而且在菌量少的情況下易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。而在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域中已經(jīng)應(yīng)用的PCR技術(shù)則可縮短檢測(cè)所消耗的時(shí)間．且敏感性更高。
2．1大腸桿菌的檢測(cè)
相關(guān)研究顯示，通過(guò)大腸桿菌特異性引物{上游引物：5 一tgttca gtg gca aga gtt一3 ．下游引物：5 一taatcgata tac ccg ctc一3 )進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以檢出飲用水中的大腸桿菌．即使在菌量極低的情況下也可以檢出 。但該研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)于不能夠破壞微生物DNA的**方**造成PCR檢測(cè)的假陽(yáng)性，而GB 15979-2002中對(duì)一次性使用衛(wèi)生用品所使用到的**方法通常為環(huán)氧乙烷**、電離輻射**和壓力蒸汽**。而這幾種**方法都會(huì)直接破壞微生物的核酸．因．tI：~,PCR技術(shù)用于檢測(cè)一次性使用衛(wèi)生用品中致病菌有可行性。
2．2綠膿桿菌的檢測(cè)
相關(guān)研究表明使用綠膿桿菌外**A (ETA)基因作為模板來(lái)快速檢測(cè)綠膿桿菌。ETA基因僅在綠膿桿菌基因
組中存在，_~_Gray[61等人已經(jīng)從一個(gè)過(guò)量表達(dá)ETA的綠膿桿菌菌株中克隆和測(cè)定了ETA的結(jié)構(gòu)基因。因此ETA基因可以作為檢出綠膿桿菌的靶基因。根據(jù)ETA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物．通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因序列 如果能夠擴(kuò)增出目的條帶，那就能據(jù)此來(lái)確定綠膿桿菌的存在。
2．3金黃色葡萄桿菌和溶血性鏈球菌的檢測(cè)
PCR技術(shù)用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的研究多數(shù)是關(guān)于食品衛(wèi)生。張亞蘭 的研究將PCR的反應(yīng)做了優(yōu)化，消除
了一些會(huì)影IJ~PCR反應(yīng)的抑制因素 從而提高檢測(cè)方法的靈敏度。同時(shí)應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)鏈球茵的研究數(shù)據(jù)顯示這
種方法具有可行性 。
3 PCR技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中可能存在的問(wèn)題
PCR技術(shù)具有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性。此外，與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)法相I：LPCR技術(shù)能縮短檢測(cè)時(shí)間，但同時(shí)將該技術(shù)引進(jìn)到衛(wèi)生用品的檢測(cè)也存在一些問(wèn)題。首先，由于檢測(cè)樣品是衛(wèi)生用品，在樣品的預(yù)處理、樣品DNA的提取等具體的操作過(guò)程中可能會(huì)遇到不同的問(wèn)題；其次．盡管PCR反應(yīng)的步驟很簡(jiǎn)單，但是具體的操作是復(fù)雜的．如退火溫度的確定、延伸時(shí)間的長(zhǎng)短以及循環(huán)數(shù)等。因此不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件以避免假陰性或假陽(yáng)性等情況的產(chǎn)生。所以要引入PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)衛(wèi)生用品中的微生物，需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，完善檢測(cè)方法
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