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一般食品微生物檢驗方法
內容提要
菌落總數(shù)檢測
大腸菌群及大腸桿菌檢測
金黃色葡萄球菌檢測
沙門氏菌檢測
單核細胞增生李斯特氏菌檢測
菌落總數(shù)測定——菌落總數(shù)的概念
菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。
菌落總數(shù)測定——衛(wèi)生學意義
判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質量。
及時反映食品加工過程是否符合
衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學評
價提供依據。
通常認為，食品中細菌數(shù)量越多，
則可考慮致病菌污染的可能性越
大，菌落總數(shù)的多少在一定程度
上標志著食品衛(wèi)生質量的優(yōu)劣。
FDA BAM 菌落總數(shù)測定流程
檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）
適當十倍稀釋樣品
選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度
各取1mL分別加入**平皿內
（每個稀釋度做兩個平行）
每皿內加入適量平板計數(shù)瓊脂（PCA）
35 ℃ ，48 ± 2h
菌落計數(shù)
FDA BAM 菌落計數(shù)方法
選擇25~250CFU之間的菌落進行計數(shù)，計算公式如下：
N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d
所有平板的菌落數(shù)都不足25CFU，報告EAPC/ml（g）為＜25*1/d。
EAPC：estimated aerobic plate count
所有平板的菌落數(shù)都超過250CFU，但不足100/cm2 ，報告EAPC/ml（g）為*接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計值，乘以相應的稀釋度。
所有平板的菌落數(shù)都超過100/cm2 ，計算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計*高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應平板面積作為該稀釋度的菌落計數(shù)結果，報告EAPC/ml（g）為＞65*100* 1/d。
無法計數(shù)的平板報告LA（Laboratory Accident）。
*終結果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進偶不進。
ISO4833-2003 菌落總數(shù)測定流程
檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）
適當十倍稀釋樣品
選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度
各取1mL分別加入**平皿內
（每個稀釋度做兩個平行）
每皿內加入適量（12~15mL）
平板計數(shù)瓊脂（PCA），
30±1 ℃ ，72 ±3 h
菌落計數(shù)
ISO4833-2003菌落計數(shù)方法
選擇連續(xù)2個稀釋度不超過300CFU的平板，且一個平板至少含15CFU進行計數(shù)，計算公式如下：
N=∑C/（n1+0.1*n2）*d
所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計算2平板菌落的算術平均值m，液體樣品：NE=m
固體樣品： NE=m×d-1
無菌生長：液體樣品：less than 1; 固體樣品：less than 1 ×d-1
*終結果保留前兩位有效數(shù)字。
菌落總數(shù)測定幾點說明
由于檢樣中采用30/35℃有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實際的總活菌數(shù)，一些特殊營養(yǎng)要求的細菌、***、微需氧菌、以及非嗜中溫細菌，均難以反映出來。
鑒于食品檢樣中的細菌細胞是以單個、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細胞塊，也可以來源于單個細胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應報告活菌數(shù)，而應以單位重量、容積或表面積內的菌落數(shù)或菌落形成單位（colony forming units，CFU）報告。
菌落總數(shù)測定幾點要求
每個樣品從開始稀釋到傾注*后一個平皿所用的時間不得超過15min，主要為防止細菌增殖和產生片狀菌落。樣液與瓊脂應充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內瓊脂凝固后，不要長時間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長。
檢樣過程中應用稀釋劑做空白對照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時，檢樣過程中應在工作臺上打開一塊空白平板計數(shù)瓊脂，其暴露時間應與檢樣時間相當，以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空氣的污染。
檢樣稀釋液有時帶有食品顆粒，為避免與細菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計數(shù)瓊脂混合的平皿，不經培養(yǎng)，于4 ℃放置，以便在計數(shù)檢樣時用作對照。
大腸菌群的定義
大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。
大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據衛(wèi)生學方面的要求，提出的與糞便污染有關的細菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據進一步的生化試驗，可將這群細菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。
大腸桿菌的定義
大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。
大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產酸產氣、IMViC試驗（靛基質、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗）為++--或-+--的細菌。
與人類有關的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸**性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。
大腸菌群和大腸桿菌的關系
衛(wèi)生學意義
大腸菌群和大腸桿菌是評價衛(wèi)生質量的重要指標，作為食品中的糞便污染指標。
食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。
大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標和HACCP實施效果的評估指標。
大腸桿菌的生物學特性
基本形態(tài)：
此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。
大腸桿菌的生物學特性
培養(yǎng)特性：
大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。*適生長溫度為37℃，在42-44 ℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 ℃。
大腸菌群及大腸桿菌測定 ——MPN法檢驗流程（FDA BAM）
檢樣50g+450ml稀釋液
適當十倍稀釋樣品
選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，
每個稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導管），
每管接種1mL
35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h
沒有產氣管 有產氣管
報告陰性
接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯
35 ± ℃ ，48 ± 2h 44.5±0.5 ℃ （水浴培養(yǎng)）
24 ± 2h ~48 ± 2h
查MPN表報告結果 產氣管接種EMB平板（35℃、18~24h）
（大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個可疑菌轉接到PCA斜
面，進行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接
種LST復檢產氣
查MPN表報告結果（大腸桿菌）
大腸菌群測定——MPN法檢驗幾點說明
MPN檢索表：
MPN 為*大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)*近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數(shù)字應相應降低或增加10倍。
初發(fā)酵和證實試驗：
1）兩步法進行了兩次乳糖發(fā)酵試驗。初發(fā)酵和證實實驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產酸產氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長，這個緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來促進菌體產氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細菌。
2）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。
產氣量與倒管：
在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內極微少的氣泡（有時比小米粒還?。袝r可以遇到在初發(fā)酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生比小米粒還小的氣泡。如果對產酸但未產氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產生，而應作進一步試驗。
大腸桿菌測定——EMB選擇性分離鑒別
EMB平板典型大腸桿
菌菌落特征：
中心黑色或紫紅色，有
或無綠色金屬光澤
大腸桿菌測定——EMB選擇性分離鑒別
EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長；
高壓**可使得美藍還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動培養(yǎng)基可以恢復原有的正常紫色，傾注平板前應先搖勻；
大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；
該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培養(yǎng)細菌時都應在避光條件。
大腸桿菌測定——革蘭氏染色
基本原理：
革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。
革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構的不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少。當用酒精或丙酮酸脫色時，類脂質被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細胞被脫色，經復染后，又染上復染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質含量少，經乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞仍保留初染時的顏色。
大腸桿菌測定——革蘭氏染色
大腸桿菌測定——革蘭氏染色
基本步驟：
將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染1min，水洗；
滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；
滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；
滴加番紅復染液，復染1min，水洗、待干、鏡檢。
結果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
大腸桿菌測定——生化鑒定
金黃色葡萄球菌——概述
根據《伯杰氏鑒定細菌學手冊》，按葡萄球菌的生理化學組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。
金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中*常見的病原菌。可引起局部化膿性感染，如癤、癰、皮下膿腫、外科切口及**創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強弱主要取決于其產生的**和侵襲性酶。
金黃色葡萄球菌——生物學特性
金黃色葡萄球菌呈球形，直
徑0.8μm左右，排列成葡萄
串狀 ，無芽孢，無莢膜。
金黃色葡萄球菌——生長特性
金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內有時液體澄清，菌量多時呈渾濁生長。
金黃色葡萄球菌檢驗——方法適用性
MPN法：適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。
直接平板計數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品。
增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。
金黃色葡萄球菌檢驗——直接平板計數(shù)法
檢樣（50g+450mL稀釋液）
適當十倍稀釋樣品
選擇2~3個連續(xù)適宜稀釋度
吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分別涂布于
3塊90mmBaird-Parker平板上（做平行試驗）
35℃ ，45~48 h
確證試驗
報告
FDA BAM 金黃色葡萄球菌檢驗——MPN法
檢樣（50g+450mL稀釋液）
適當十倍稀釋樣品
選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，
每個稀釋度接種三管10% NaCl TSB肉湯，
每管接種1mL
35℃ ，48 ±2 h
從生長的管中接種1環(huán)劃線于 Baird-Parker平板上
35℃ ，48 h
確證試驗
報告
FDA BAM 金黃色葡萄球菌確證試驗
1.凝固酶試驗
方法：從平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌菌落，移種到TSB/BHI肉湯中，置35℃培養(yǎng)18-24h。取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗兔血漿充分混合，置35℃培養(yǎng)，定時觀察是否有凝塊形成，至少觀察6h。
試驗中需同時做已知陽性和陰性對照。
結果判定：以內容物完全凝固，使試管倒置或傾斜時不流動為陽性。部分凝固（2+和3+）的必須進行生化鑒定加以證實。
FDA BAM金黃色葡萄球菌確證試驗
2.革蘭氏染色
對所有的可疑培養(yǎng)物都要進行革蘭氏染色。
3.生化鑒定
過氧化氫酶試驗
葡萄糖厭氧利用試驗
甘露醇厭氧利用試驗
金葡溶菌酶敏感性試驗
耐熱核酸酶試驗（輔助）
FDA BAM 2種葡萄球菌和微球菌的典型特性
ISO 金黃色葡萄球菌檢驗——MPN法
檢樣（xg+9xmL稀釋液）
適當十倍稀釋樣品
選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，
每個稀釋度接種三管
modified Giolitti and Cantoni broth，
37℃ ，24~48 h
從變黑或出現(xiàn)黑色沉淀的管中
接種1環(huán)培養(yǎng)物于 Baird-Parker平板上
37℃ ，48 h
確證試驗
報告
ISO 金黃色葡萄球菌確證試驗
凝固酶試驗
結果判定：
- 1+ 2+ 3+ 4+
沙門氏菌屬簡介
1880年E. Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬霍亂沙門氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。
沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學相關的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結構復雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2000多個血清型，我國已發(fā)現(xiàn)血清型近200個。
沙門氏菌屬——生物學特性
形態(tài)特征：
革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運動力強。
培養(yǎng)特性：
沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10-42 ℃都可生長，*適生長溫度為37℃，*適pH為6.8~7.8。
營養(yǎng)瓊脂平板上：35~37℃培養(yǎng)18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、濕潤、無色、半透明、邊緣整齊。
血平板上：中等大小的灰白色菌落。
沙門氏菌屬的抗原
菌體抗原（O抗原）
表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原
鞭毛抗原（H抗原）
纖毛抗原
FDA BAM沙門氏菌檢驗流程
前增菌 25g樣+225mL乳糖肉湯 （肉制品、肉副產品、動物產品）
勻質2min，室溫放置60 ±5min
混合均勻，測定調節(jié)PH6.8 ±0.2
35℃、24 ± 2h
選擇性增菌
0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB
42℃、24h
（水浴培養(yǎng)） 35℃、24h 43℃、24h（水浴培養(yǎng)）
含菌量高 含菌量低
分離培養(yǎng) 劃線接種 選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、HE）
35℃、24~48h（BS）
生化鑒定 每個平板挑取至少2個可疑菌（包括典型和非典型各2個）
接種TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面（LIA高層深4cm）
（松蓋以保持有氧條件防止產生過多H2S）
35℃、24±2h
棄去 尿素酶試驗 衛(wèi)矛醇、 ***、丙二酸鈉、吲哚試驗
陽性 陰性
血清學 血清學試驗——沙門氏菌的分類
報告結果
ISO6579沙門氏菌檢驗流程
前增菌 25g樣+225mLBPW
勻質
37±1℃、18 ± 2h
選擇性增菌
0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn
41.5 ± 1℃、24 ± 3h 37 ± 1℃、24 ± 3h
（水浴培養(yǎng)）
分離培養(yǎng) 劃線接種選擇性培養(yǎng)基（XLD和**種選擇性培養(yǎng)基，如 BS）
37℃、24~48h（BS）
每個平板挑取至少5個可疑菌進行純培養(yǎng)和確認試驗
37℃、24±3h
生化鑒定 TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、 吲哚試驗
血清學 血清學試驗——沙門氏菌的分類
報告結果
ISO6579沙門氏菌生化試驗表
沙門氏菌檢驗選擇性分離培養(yǎng)
XLD瓊脂：
FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈
現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落。
——非典型菌落：黃色帶或不帶黑色中心。
ISO——中心黑色、周圍由于指示劑顏色的改變而出現(xiàn)紅色的輕微透明帶。
沙門氏菌檢驗選擇性分離培養(yǎng)
BS瓊脂：
FDA BAM——典型菌落：產硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周
圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時間的延長而
變?yōu)楹谏?，并有暈環(huán)效應；
——非典型菌落：有些菌株不產生硫化氫，形成灰綠色菌落，周圍培養(yǎng)
基不變色。
沙門氏菌檢驗選擇性分離培養(yǎng)
HE瓊脂：
FDA BAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產硫化氫，菌落帶或不帶黑色
中心或幾乎全黑色。
——非典型菌落：乳糖陽性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。
沙門氏菌檢驗生化鑒定
TSI：
典型反應：斜面產堿（K）：紅色； 底部產酸（A）：黃色；
產H2S：黑色（少數(shù)不產）
沙門氏菌檢驗——幾點注意
冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動調溫器自控的水浴鍋內不斷攪拌進行15min或在2-8℃，18小時內軟化。
為保證檢驗的準確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進行生化和血清學鑒定。
進行生化反應時，應以純培養(yǎng)物進行試驗，如出現(xiàn)血清學陽性，而生化反應特征不符合時，應對接種物進行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進行生化試驗。
測試中應同時接種陽性對照菌株。
李斯特菌屬簡介
《伯杰氏鑒定細菌學手冊》第9版中，李斯特菌屬有7個種：單核細胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英諾克李斯特氏菌（L. innocua） 、西爾李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威爾斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、綿羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。
單核細胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起動物的感染，也可引起人的感染。
單核細胞增生李斯特氏菌——生物學特性
形態(tài)特征：
革蘭氏陽性短桿菌，大小為0.4~0.5×0.5~2μm， 兩端鈍圓，常兩兩相串成彎曲及V形，偶爾有球狀、雙球狀、短鏈狀，但很少有長鏈狀，兼性厭氧、無芽孢，一般不形成莢膜。該菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脫落。20℃培養(yǎng)后可見到很多鞭毛。
培養(yǎng)特性：
生長溫度為2~42℃（冷藏不能阻止該菌的生長），*適生長溫度為35~37℃。20~25 ℃培養(yǎng)有動力，37 ℃培養(yǎng)動力消失；在顯微鏡下觀察該菌新鮮的室溫肉湯培養(yǎng)物可見翻筋斗運動。
在pH3.8~4.4仍能生長，在pH中性至弱堿性（9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，
在6.5%NaCl肉湯中也能良好生長。
血平板上：菌落通常不大呈灰白色，
刺種血平板可產生窄小的β溶血環(huán)。
FDA BAM單核細胞增生李斯特氏菌檢驗流程
檢樣25g
增菌 EB增菌液基礎225mL
30℃ 4h
加入抑菌劑
30℃ 20h 30℃ 44h
選擇性分離培養(yǎng) 接種OXA和 PALCAM 接種OXA和 PALCAM
35℃ 24-48h 35℃ 24-48h
生化鑒定 TSA-YE純培養(yǎng)
30℃ 24-48h
典型運動 TSB-YE
過氧化氫酶試驗
革蘭氏染色
溶血試驗
ISO單核細胞增生李斯特氏菌檢驗流程
測試樣品（x g或x mL）
+9x mL一次增菌培養(yǎng)基（Half Fraser肉湯）
30℃培養(yǎng)24±2h
1mL培養(yǎng)液加入 劃線接種Oxford瓊脂
10mL二次增菌培養(yǎng)基中 和PALCAM瓊脂
（Fraser肉湯）
35℃或37℃培養(yǎng)48±2h 30℃、35℃或
劃線接種Oxford瓊脂 37℃培養(yǎng)24-48h
和PALCAM瓊脂
30℃、35℃或37℃培養(yǎng)24-48h
李斯特菌屬的確證：
- 挑取可疑菌接種TSAYE培養(yǎng)基
- 過氧化氫酶試驗
- 革蘭氏染色
- 動力試驗
單核細胞增生李斯特菌的確證：
- 溶血試驗
- 碳源利用試驗
- CAMP（協(xié)同溶血）試驗
單核細胞增生李斯特氏菌選擇性分離培養(yǎng)
OXA瓊脂
FDA：灰黑色菌落，周圍有黑色環(huán)。
ISO：生長在牛津瓊脂上24h的典型李
斯特氏菌呈小（1mm）、灰色的菌落
外圍是黑色的暈輪；48h后菌落變暗，可能見到綠色的輝光，直徑約2mm。 有黑色的暈輪并且中間凹陷。
Oxford 瓊脂平板培養(yǎng)于30℃適合于僅受額外菌群輕度污染的食品，對于受額外菌群重度污染的食品，*好培養(yǎng)于35℃或37℃，因為李斯特氏菌趨于和額外菌群一同生長。
單核細胞增生李斯特氏菌選擇性分離培養(yǎng)
PALCAM瓊脂
李斯特氏菌屬——動力和過氧化氫酶試驗
傘狀動力
挑取TSBYE肉湯培養(yǎng)物穿刺接種SIM或半固體動力培養(yǎng)基試管，25℃培養(yǎng)5-7d。
李氏菌有動力、呈現(xiàn)典型的傘狀生長。
典型運動
挑取25℃培養(yǎng)的TSAYE平板上的菌落，
制備水浸片，顯微鏡下觀察
李氏菌的翻滾、旋轉運動。
過氧化氫酶試驗
李氏菌過氧化氫酶陽性
單核細胞增生李斯特氏菌——溶血試驗
制備5~7%羊血瓊脂平板。
挑取TSAYE平板上的典型菌落刺種血平板，刺種時避免接觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時接種陽性（單核細胞增生李斯特氏菌）和陰性（英諾克李斯特氏菌）對照。
單增呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的β-溶血；
西爾李氏菌出現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象；
綿羊李氏菌通常呈寬的、
輪廓清晰的β-溶血；
英諾克李氏菌不產生溶血現(xiàn)象。
單核細胞增生李斯特氏菌——協(xié)同溶血試驗（CAMP）
方法：在羊血瓊脂平板上平行接種β-溶血金黃色葡萄球菌（S.aureus）和馬紅球菌(R.equi),在它們中間垂直劃線接種可疑菌，與兩線相近但不相交，在30℃培養(yǎng)24h-48h,檢查平板中垂直接種點對溶血環(huán)的影響。
結果：靠近金黃色葡萄球菌接種點的單增李斯特氏菌的溶血增強，西爾李斯特氏菌的溶血也增強，綿羊李斯特氏菌在馬紅血球附近的溶血增強。
單核細胞增生李斯特氏菌——協(xié)同溶血試驗（CAMP）
ISO李斯特氏菌鑒定反應
FDA李斯特氏菌屬的區(qū)別
幾種常用稀釋緩沖液介紹
磷酸鹽緩沖液
儲備液的制備：稱取34g磷酸二氫鉀溶解于500ml蒸餾水中，用1NNaOH
溶液調整pH值為7.2，再用蒸餾水稀釋至1000ml，121℃高壓**15min，
于冰箱中儲存。
稀釋液的制備：取1.25ml儲備液，用蒸餾水稀釋至1000ml，定量分裝，
121℃高壓**15min備用。
0.85%生理鹽水
稱取8.5gNaCl溶解于1000ml蒸餾水中，定量分裝，121℃高壓**
15min備用。
0.1%蛋白胨水
稱取1g蛋白胨溶解于1000ml蒸餾水中，定量分裝，121℃高壓**
15min備用。蛋白胨水對細菌細胞有更好的保護作用，不會因為在稀釋
過程中使檢樣中原已受損傷的細菌細胞導致死亡。
無菌水